Immunisation

Il s'agit d'une inoculation (1), généralement par voie péritonéale, d'un antigène ou d'un haptène à un animal de laboratoire (souvent un glire, les plus courants étant la souris, le rat ou le lapin) ce qui a pour effet de produire des plasmocytes libérant des anticorps contre cet antigène. Des anticorps différents (polyclonaux) sont produits pour combattre l'antigène. Il est possible d'obtenir des anticorps reconnaissant des substances qui ne sont pas immunogéniques, en les conjuguant à des protéines immunogéniques, comme la BSA, le KLH (en) ou le DNP. Plusieurs protocoles d'immunisation sont possibles en variant les doses, les intervalles des injections, l'adjuvant utilisé et la durée du traitement. L'adjuvant utilisé est principalement l'adjuvant de Freund, soit incomplet (émulsion d'eau, d'huile minérale et d’un agent émulsifiant), soit complet (complexe d’eau, d’huiles, d’émulsifiants et de morceaux de bactéries tuées). Cette injection a pour effet de produire des plasmocytes libérant des anticorps polyclonaux contre cet antigène. Les modalités d'action des adjuvants dans les préparations vaccinales sont de deux types :

• le premier favorise et prolonge la durée de l’interaction entre l’antigène et le système immunitaire ; c'est le cas par exemple de l’hydroxyde d’alumine ;
• le second recrute et active les cellules de l’immunité naturelle pour qu’elles induisent la réponse adaptative.

Fusion

Ensuite, l'animal est sacrifié et les cellules B sont isolées à partir de la rate (2). Celles-ci, ne pouvant se multiplier mais produisant les anticorps désirés, sont fusionnées (4) avec des myélomes (cellules cancéreuses, donc aptes à une division cellulaire rapide et immortelles). Cette étape de fusion peut être effectuée en utilisant le PEG ou par électroporation. Ces cellules sont ensuite mises en culture ; ces hybridomes ayant la propriété des cellules cancéreuses, elles se multiplient rapidement et indéfiniment.

Propagation, sélection et clonage

Les cellules myélomateuses utilisées pour la fusion ne produisent pas d'anticorps ou une des chaînes d'anticorps. De plus, ces cellules ont perdu (par sélection génétique) la faculté de produire une enzyme appelée hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransférase (HGPRT). Cette enzyme est impliquée dans la synthèse des nucléotides, plus particulièrement dans la voie de sauvetage (par opposition à la voie de novo). La sélection des cellules fusionnées se fait avec les composés chimiques hypoxanthine, aminoptérine et thymidine (milieu HAT). L'aminoptérine, en bloquant la synthèse de novo des nucléotides, oblige les cellules à utiliser la voie de sauvetage. Les myélomes parents n'ayant pas l'enzyme essentielle, seules les cellules fusionnées avec les splénocytes et l'ayant ainsi acquise pourront survivre. L'hypoxanthine et la thymidine sont les substrats de cette voie de sauvetage. Par ailleurs, les cellules B non fusionnées s'élimineront d'elles-mêmes, étant incapables de se reproduire.

À la suite d'une période de sélection dans le milieu HAT, les hybridomes se développent en colonies. Le taux de succès d'une fusion est plutôt faible et varie selon le protocole utilisé (de 5 % à 50 % ). Afin de favoriser la croissance de ces hybridomes, plusieurs additifs peuvent être ajoutés dans le milieu de culture (FBS, facteur de croissance, couche de cellules nourricières). Ces lignées d'hybridomes sécrètent des anticorps tous différents. Afin de sélectionner l'anticorps d'intérêt, il faut d'abord isoler chacun des clones (5). Classiquement, cette sélection se fait par dilution limite pour permettre l'isolement de clones uniques. Plus récemment, l'utilisation du cytomètre en flux permet aussi la séparation de cellules. Après une seconde ronde de culture, chaque clone est ensuite testé, la plupart du temps en Western Blot, par ELISA ou par RIA, afin de vérifier sa capacité à lier l'antigène ou l'haptène utilisé pour l'immunisation. Les anticorps sécrétés sont ensuite testés pour éliminer ceux qui induisent des réactions croisées avec d'autres antigènes.

Production

Après la sélection, la production de lots d'anticorps se fait par purification d'un milieu biologique contenant l'anticorps en solution, celui-ci étant soit un ascite produit chez l'animal (c’est-à-dire une injection intrapéritonéale de l'hybridome dans un animal préparé — ) (7b), soit un surnageant de culture cellulaire ayant servi à cultiver l'hybridome in vitro (7a). Selon l'échelle de grandeur désirée, la production en suspension cellulaire peut se faire dans des bioréacteurs. La purification proprement dite peut se faire de différentes manières, comme la chromatographie liquide haute performance, par affinité avec la protéine G ou par précipitation à l'ammonium.

Une fois obtenu un clone d'hybridome sécrétant un anticorps de spécificité voulue, il sera caractérisé afin de connaître la classe des chaînes d'immunoglobuline, son affinité, ou l'épitope reconnu (epitope mapping). Il est possible de déterminer la séquence d'ADN du gène des immunoglobulines de ce clone, de le sous-cloner et de le modifier. Ceci permet de produire des anticorps chimériques (médicaments possédant le suffixe -ximab, « mab » pour Monoclonal AntiBody) ou humanisés (suffixe -zumab), ou encore de produire uniquement le fragment de l'anticorps Fab reconnaissant l'antigène.