الاستِشراب السَّائِل الرَّفيع الإنجَاز[1] أو الاستشراب السائلي عالي الأداء[2] (High performance liquid chromatography) هي تقنية لفصل مكونات مزيج ما كل على حدة. وعادة تفضل طرق الاستشراب السائل فائق الأداء High-performance liquid chromatography (HPLC) على الطرق المتبعة الأخرى في التحليل الكمي. وذلك لنوعيتها المثالية للحليلة analyte أو الحلائل المراد فصلها، بحيث نحصل على فصل نوعي دقيق لمكونات المزيج المراد التعرف عليه. (كروماتوغرافيا سائلة عالية الضغط، HPLC)هو شكل من أشكال الكروماتوجرافيا العمودية وغالبا ما تستخدم في الكيمياء الحيوية والكيمياء التحليلية لفصل وتحديد، وقياس المركبات في مخلوط واحد . تستخدم عمود يحتوي على الطور الثابت (stationary Phase) ومضخة تحرك الطور المتنقل المراد تحليله (Mobile Phase) و كاشف لتحديد زمن الاحتباس لكل مادة. زمن الاحتباس يختلف من مادة لأخرى بسبب الاختلاف في الروابط البينية بين المادة المراد تحليلها والمادة الثابتة في العمود مما يؤخر ظهور المادة على الكاشف.
شرح النظرية
يتم ادخال المادة المراد تحليلها في تيار المادة الناقلة . سرعة تحرك المادة داخل العمود تتحدد بكم الروابط الفيزيائية أو الكيميائية بينها وبين المادة الساكنة . كمية المادة المنحبسة تعتمد على تركيب المادة وتركيب المادة الساكنة والمادة الناقلة أو المتحركة . الوقت الذي تستغرقه المادة المنحبسة داخل العمود لكي تصل للطرف الآخر للعمود وتظهر على الكاشف يسمي وقت الاحتباس .
إن أجهزة الـ HPLC متوفرة بسهولة لأنها تستخدم في مجالات متعددة منها مجال التقنية الحيوية التقنية الطبية السريرية والتحاليل الصيدلانية. إضافة إلى استخدامها في الكيمياء ومستحضرات التجميل وفي الطاقة والبيئة والصناعات الغذائية. كما أن توافر أجهزة بأسعار مقبولة وذات كفاءة متطورة وموثوقة قد جعل أجهزة الـHPLC هي الطريقة المفضلة في التحاليل الصيدلانية وذلك بدءً من إنشاء تركيب العقار أو فصل مكوناته أو ضبط جودته. لقد تطور استخدام الـHPLC بشكل كبير خلال العقود الماضية ففي الستينات تم وضع الأسس والمبادئ النظرية لهذه التقنية، وأدى التطور في مواد تعبئة عمود الاستشراب في السبعينات إلى تطور الاستشراب بالطور العكوس. وفي الثمانينات أدى التطور في الحواسيب والأتمتة إلى سهولة استخدام الـ HPLC . وفي التسعينات طورت أعمدة الاستشراب الميكرونية (الصغيرة) وأعمدة الاستشراب المتخصصة لاستعمال محدد، المشعرات (الكواشف) Detector الثابتة، بالإضافة إمكانات الحصول على البيانات المتكاملة وتخزينها واسترجاعها، مما أدى إلى الزيادة الكبيرة في فعالية وسرعة أجهزة الـ HPLC.
مفاهيم وتعاريف أساسية، ونظرية الكروماتوغرافيا
الطور المتحرك (mobile phase): لفصل مكونات مزيج ما، ندخل السائل المراد فصل مكوناته في تدفق متتابع، وهذا ما يسمى بالطور المتحرك (mobile phase).
الطور الثابت (stationary phase) وتترك الحلالة لتعبر خلال طبقة عمود الاستشراب الحاوي على مواد ( جزيئات ) أقطارها صغيرة جداً مما يمنحها سطح تماس كبير، وهذا ما ندعوه بالطور الثابت stationary phase.
الماد المذابة(الذوائب solutes) وطالما تعبر جزيئات الحلالة عمود الاستشراب محمولة في الطورالمتحرك فإنه يتم تآثر Interaction مستمر بين جزيئات الحلالة (أو الذوائب solutes) وبين الطور الثابت وكذلك أيضاً مع الطور المتحرك، وينتج عن هذا توازن ديناميكي dynamic equilibrium. كما يؤدي اختلاف عمليات التوازن هذه إلى فصل مكونات هذا المزيج.
(الإمرار) المتماثل isocratic elution وعندما تتم عملية فصل مواد المزيج مع المحافظة على التركيب الثابت لمكونات الطور المتحرك، فإننا ندعو هذه العملية بالشطف (الإمرار) المتماثل isocratic elution.
الشطف المتدروج gradient elution فهو التغير المستمر لتركيب الطور المتحرك كنسبة نوع أو أكثر من المذيبات في الطور المتحرك كتابع للزمن.
كاشف detector عندما تخرج جزيئات الحلالة من مناطق الطور المتحرك فإنها تمر عبر كاشف detector أو سلسلة من الكواشف (المتحريات). وتستجيب إشارات الكاشف كدالة على تركيز الحليلة (المادة المذابة) في مناطق الطور المتحرك.
برامج تحليل بيانات data processors ترسل هذه الإشارات إلى برامج تحليل بيانات data processors والذي يرسم الخطوط البيانية plot كدالة مع الزمن.
المخطط الاستشرابي chromatogram ويدعى المخطط الذي يظهر هذه الإشارات بالمخطط الاستشرابي chromatogram ، وتدعى مناطق المكونات لكل مركب بالقمم الاستشرابية chromatographic peaks . وتتميز هذه القمم بالمعايير(المتثابتات) parameters التالية : العرض، المساحة، ارتفاع القمة، ومدى التذييل tailing، وزمن العبور (الاحتفاظ) retention time. ويدعى الجهاز الذي يقوم بهذ العمل جهاز مخطط الاستشراب (مخطاط الاستشرابي) chromatograph. المحقن في الـ HPLC تدخل الجزيئات الذائبة ضمن سيل الطور المتحرك. ويمر هذا السيل عبر مدخل inlet وينبثق عبر مخرج outlet العمود.
المضخة عالية الضغط pump وبما أن أبعاد الأجزاء صغيرة جداً (حوالي 10 ميكرون أو أقل) والعمود مملوء بشكل كامل فإنه لا بد من دفع حركة الطور المتحرك باستخدام مضخات عالية الضغط. وإن الجزيئات الذائبة فقط هي التي تنتقل عبر الطور المتحرك. والجزيئات التي تتفاعل مع سطح العمود سيحدث لها عرقلة impeded بالخروج، والعصبة الناشئة عنها سيحدث لها لفظ متأخر عن لفظ العصبة التي تتثبت جزيئاتها بشكل أضعف. إن النزوح النسبي للذائبة يعتمد على خواصها الحركية والترموديناميكية.
العوامل المؤثرة على كفاءة الفصل
إن مدى وكفاءة الفصل بين قمتي لفظ متقاربتين يعبَّر عنها بعامل الاحتباس أو عامل السعة (retention (or capacity) factor (k’) ، وعامل الاصطفاء selectivity factor ، و عدد الطبقات النظرية N. إن عامل السعة هو قياس زمن التصاق جزيئات الذائبة بأجزاء العمود مقارنة مع زمن التصاقها بالطور المتحرك. لذلك كلما كبرت قيمة K’ كلما زاد التثبت على أجزاء العمود.[3]
المراجع
- القاموس الطبي الموحد. نسخة محفوظة 08 ديسمبر 2017 على موقع واي باك مشين.
- "القاموس العلمي المُصوّر الجديد". مؤرشف من الأصل في 8 ديسمبر 201724 مارس 2017.
- ( كتاب إلكتروني PDF ) https://web.archive.org/web/20120617061134/http://www.cem.msu.edu/~cem333/Week16.pdf. مؤرشف من الأصل ( كتاب إلكتروني PDF ) في 17 يونيو 2012.