الانتساخ الفاشل، أو النسخ، يحدث عندما يتم محاصرة إنزيم رنا بوليميراز RNA polymerase [1] بشكل متكرر في أحد المحفزات متسببًا في عمليات انتساخ قصيرة فاشلة (أو عمليات نسخ، عادة طولها من 2 إلى 12 عملية انتقال نووي). أثناء عملية النسخ الفاشلة، لا يترك إنزيم رنا بوليميراز المحفز. أما خلال عملية النسخ الطبيعية[2]، فإن إنزيم الرنا بوليميراز يخضع في نهاية المطاف إلى تغيير متعلق بتكوين جزئي إلى مستقر، مجمّع استطالة متتابع، وتسمى هذه العملية هروب المحفز، ويستمر النسخ بعد ذلك حتى يتم الوصول إلى إشارة الانتهاء. يجري إعداد المحفزات الصناعية أو أشرطة التحفيز الفاشلة "APC" (APCs[3]) وإنزيمات الرنا بوليميراز الفاشلة التي يطلق عليها "Abscriptases" التي تحاصر إنزيم رنا بوليميراز في أحد المجمعات الفاشلة، وتقوم بشكل متكرر بتجميع الآلاف من أليجوكليوتيد المتماثلة القصيرة في الدقيقة.[4] تتم برمجة كل شريط من أشرطة التحفيز الفاشلة لعمل نسخة مختلفة ذات طول وتسلسل محددين والتي يمكن فصلها وتحديد كميتها. تتم عملية النسخ بنجاح حيث تنتج ثلاثي النيوكليوتيدات بمعدل 1000 إلى 10000 نسخة في الدقيقة.
يتم إنتاج مجموعة موحدة من ثلاثي النيوكليوتيدات في وجود بادئ ثنائي النوكليوتيد (مثل GpA) وريبونوكليوزيد-ثلاثي الفوسفات (مثل GTP) المشفرة بواسطة شريط التحفيز الفاشل المرفق. في هذا المثال، يحمل شريط التحفيز الفاشل تسلسل الحمض النووي DNA CpTpC ويقوم بتشفير التخليق المتكرر لريبونوكليوتيد GpApG. ستنتج خطوة البلمرة الواحدة نسخة من ثلاثي النوكليوتيد إضافة إلى بيروفوسفات غير العضوية. يمكن رصد أي من ثلاثي النوكليوتيد أو البيروفوسفات الناتجة أو كليهما أو خطوة البلمرة نفسها وتحديد كميتها. يتم رصد النسخ غير المعدلة وتحديد كميتها بواسطة LC-MS (الاستشراب السائل – قياس الطيف الكتلي أو RTLC "الاستشراب السريع للطبقة الرقيقة")، ولكن استخدام النوكليوتيدات المعدّلة كركائز للنسخ يسمح بحدوث أنواع أخرى من الرصد (الكهربائي الشعيري، التفلور).[5][6] إن إجراء تعديلات على النهاية الخامسة 5’ لبادئ ثنائي النوكليوتيد تنتج نسخ فلورية. إن ربط البيوتين بالنهاية الخامسة 5’ يسمح بالتقاط النسخ.
يمكن رصد المؤشرات الحيوية الجزيئية مثل الرنا RNA والبروتين والحمض النووي DNA (بما في ذلك مثيلة الحمض النووي DNA،[7][8], والتكبير والحذف والإدخال ونقل الأماكن والطفرات) وتحديد كميتها بواسطة إدخال رابطة تساهمية من شريط التحفيز الفاشل إلى الهدف.[9][10] يمكن ربط أشرطة مختلفة من APC، التي تقوم بتشفير نسخ مختلفة، بالأهداف المختلفة لأغراض تعدد الرصد. يتم تحديد كمية النسخ الناتجة أثناء عملية النسخ وتوفير قياس مباشر لحجم المؤشر الحيوي الذي تم ربط شريط التحفيز الفاشل به.
المراجع
- RNA polymerase - Wikipedia, the free encyclopedia
- Transcription (genetics) - Wikipedia, the free encyclopedia
- U.S. 7,473,775: Abortive Promoter Cassettes; Issued 01/06/2009
- U.S. 7,541,165: Molecular Detection Systems Utilizing Reiterative Oligonucleotide Synthesis; Issued 06/2009; Claims to Abscription methods for detecting proteins
- U.S. Patent 8,211,644 “Molecular beacon based methods for detection of targets by Abscription” Issued 2012
- Molecular beacon - Wikipedia, the free encyclopedia
- DNA methylation - Wikipedia, the free encyclopedia
- David R. McCarthy, Philip D. Cotter, and Michelle M. Hanna (2012). MethylMeter(r): A Quantitative, Sensitive, and Bisulfite-Free Method for Analysis of DNA Methylation, DNA Methylation - From Genomics to Technology, Dr. Tatiana Tatarinova (Ed.), , InTech, DOI: 10.5772/36090. Available from: http://www.intechopen.com/books/dna-methylation-from-genomics-to-technology/methylmeter-a-quantitative-sensititive-and-bisulfite-free-method-for-analysis-of-dna-methylation
- U.S. 7,470,511: Methods Determining Nucleic Acid Methylation; Issued 12/20/08
- U.S. 7,468,261: Molecular Detection Systems Utilizing Reiterative Oligonucleotide Synthesis; Issued 12/23/08; Claims to Abscription Methods for Detecting DNA and RNA
6. U.S. 7,226,738: Molecular Detection Systems Utilizing Reiterative Oligonucleotide Synthesis; Issued 6/05/07; Claims to Abscription methods for detecting multiple reiterated oligonucleotides using a target site probe and/or formation of a bubble complex 7. U.S. 7,045,319: Molecular Detection Systems Utilizing Reiterative Oligonucleotide Synthesis; Issued 5/16/06; Claims to Abscription methods for detecting methylated cytosine residues at CpG sites in a target DNA polynucleotide 7. U.S. Patent 8,263,339 “Abscription Based Molecular Detection” Issued 2012 8. U.S. Patent 8,242,243 “Methods and Reagents for Detecting CpG Methylation with a Methyl CpG Binding Protein (MBP)” Issued 2012