الرئيسيةعريقبحث

لطخة ساوثرن

لطخة ساوثرن[1] أو لطخة ساوثيرن[1] (Southern blot)‏ هي عبارة عن طريقة تستخدم في البيولوجيا الجزيئية للكشف عن حمض نووي في عينة حمض نووي معينة. وصمه ساذرن تدمج بين عملية نقل جزيئات الحمض النووي المفصول كهربائيا إلى غشاء و يتم الكشف عن هذه الاجزاء من خلالقطعة من الحمض النووي المهجنة (probe ).

تسمى هذه الطريقة نسبة إلى مخترعها، عالم الاحياء ايدوان ساذرن [2] ومثال ذلك طرق اخرى (وصمة ويسترن [3] , وصمة نورثن، وصمة ايسترن، وصمة سواثويسترن ) حيث تطبق فكرة مشابهة لكن باستخدام الحمض النووي (RNA ) أوالبروتين، سميت مؤخرا نسبة إلى اسم ايدوان ساذرن. عندما تكون العينة مسامية يكتب ساذرن بحرف كبير على العينة إذا ما حولناه إلى أسماء. ويمكن اتباع هذا التحليل في كل الطرق.[4]

الطريقة

1-تستخدم انزيمات الاقتطاع الداخلية لقطع الحمض النووي ذو الوزن الجزيئي الكبير إلى جزيئات صغيرة .

2-جزيئات الحمض النووي يتم تعريضها إلى كهرباء في جل يسمى (اغاروز) لتفصلهم حسب الحجم .

3-إذا كانت جزيئات الحمض النووي أكبر من 15kb , نقوم قبل الوصمة بمعالجة الجل بحمض مثل حمض الهيدروكلورايد المخفف .و هذا يزيل (purine ) من جزيئات الحمض النووي، ويكسره إلى جزيئات اصغر مما يؤدي إلى نقل الحمض النووي بكفاءه أكثر من الجل إلى الغشاء .

4-إذا تم استخدام طريقة النقل القاعدي، يتم وضع جل الحمض النووي في محلول قاعدي ( عادة تكون صوديوم هيدروكسايد ) حتى يتم تفكيك السلسلة المزدوجة للحمض النووي، عملية التفكيك (التمسيخ) في بيئه قاعديه قد يحسن الرابطة بين الثايمين سالب الشحنة في الحمض النووي و مجموعة الامين موجبة الشحنة في الغشاء، يعمل على فصل الحمض النووي إلى سلسلة واحدة للتهجين في وقت آخر ( انظر في الاسفل ) و لتحطيم أي بقايا منالحمض النووي ( RNA ). اختيار الوسط القاعدي بدل المتعادل هي عملية تجريبية وقد تؤدي إلى نفس النتائج .

5-يتم وضع غشاء مكون من النايتروسيليلوز (أو نايلون ) فوق الجل ( أو تحته، تعتمد على اتجاه الانتقال ).ثميتم تطبيق ضغط على الجل ( اما باستخدام الشفط أو من خلال وضع كمية كبيرة من الفاين الورقي و وزن أعلى الغشاء و الجل ) , للتاكد من انه قدم تم اتصال كامل و متساوي بين الجل والغشاء . إذا تم النقل من خلال الشفط , 20x SSC ,يتم استخدام محلول منظِّم ( buffer )للتاكد من الاغلاق التام ومنع جفاف الجل .يتم نقل المحلول المنظِّم ( buffer ) من خلال الخاصية الشعرية من منطقة مياه ذات تركيز عالي إلى منطقه تركيز منخفض ( عادة ورق الفلترة وورق الفاين ) وبعدها يستخدم لنقل الحض النووي من الجل إلى الغشاء : تفاعلات تبادل تؤدي لربط الحمض النووي إلى جعل الغشاء بسبب الشحنة السالبة للحمض النووي و الشحنة الموجبة للغشاء.

6- ينقل الغشاء ليتم خبزه في فرن فراغي أو فرن منتظم على درجة حرارة 80سيلسوس لمدة ساعتين ( تحت ظروف معيارية : غشاء النايتروسيليلوز أو نالون) أو يتم تعريضه للاشعة فوق البنفسجية ( غشاء النايلون) حتى يلتصق الحمض النووي المنقول ( DNA ) بالغشاء بشكل دائم .

7-يعرض الغشاء إلى قطعه مهجنة من الحمض النووي - هي عبارة عن قطعة من سلسله (DNA ) واحدة تحتوى ترتيب معين من النيكلوتايد موجود بسلسله الحمض النووي المراد فحصها وتحديدها . وهذه القطعة المهجنة يتم تعليمها حتى نتمكن من كشفها، عادة ما يتم تميزها بدمجها مع جزيئات مشعه أو اصباغ مشعه تنتج الوان . في بعض الحالات، قد تصنع هذه القطعة المهجنة من (RNA ) . للتاكد من خصوصية ارتباط هذه القطعة مع عينة الحمض النووي، يتم استخدام الحمض النووي الموجود في الحيوان المنوي لسمك السلمون اوسمك الرنجة لتغلق سطح الغشاء وتخخصه للحمض النووي في العينة و مادة الفورماميد منزوعة التأين، و مطهر مثل (SDS ) لاختزال الروابط الغير مخصصة في القطعة .

8-بعد التهجين، قطع ( probe ) الزائدة تغسل من الغشاء ( ايضا باستخدام (SDS buffer ) , ويتم مشاهدة عملية التهجين من خلال اشعة اكس باستخدام التصوير الاشعاعي الذاتي في حالة المواد النشطة اشعاعيا أو المشعة، أو من خلال تطوير اللون على الغشاء باستخدام طريقة اكتشاف تولد اللون .

النتائج

تهجين قطعه (probe ) إلى قطعة حمض نووي محدده على الغشاء يدل على ان الحمض النووي يحتوي على ترتيب مكمل للترتيب الموجود على (probe ) . خطوة نقل الحمض النووي ( DNA( من الجل الكهربائي إلى الغشاء تسهل ربط القطعة المعلمة مع قطعه الحمض النووي المفصولة حسب الحجم . وايضا يسمح بتثبيت probe الذي نحتاجه ويتم تحليله من خلال التصوير الاشعاعي الذاتي أو طرق كشف اخرى .وصمة ساذرن متشكله مع انزيم يعمل على تقطيع الحمض النووي وقد يستخدم لمعرفة عدد الترتييبات ( عدد الجينات ) في الجينوم . قطعه ( ( probeالتي تهجن إلى قطعه واحدة من الحمض النووي و التي لم يتم تقسيمها بواسطة انزيم التقطيع سوف تعطي شريط واحد على وصمة ساذرين بالمقابل عدة أشرطة غالباً سوف تنتج عندم يتم تهجين ( ( probeإلى عدة قطع متشابهة الترتيب بشكل كبير (تلك التي تنتج من عملية تضاعف الحمض النووي أثناء انقسام الخلية) تغير ظروف التهجين ( مثال زيادة درجة الحرارة أو نقصان تركيز الاملاح ) تستخدم لزيادة التحديد والخصوصية لتسلسل النيكليوتايد لقطعة ( probe ) و انقاص تهجين ال ( ( probe إلى ترتيبات بنسب تشابه أقل من 100%. التطبيقات وصمة ساذرين تستخدم لعملية الإستنساخ المعتمدة على تطابق ترتيب الحمض الأميني للبروتين الناتج مع الجين المستهدف النكليوتايدات المتعدة مصممة حتى ينتج ترتيب مماثل للترتيب المستهدف . متعدد النيكليوتايد يصنع كيميائيا و هو مميز اشعاعيا، ويستخدم لعرض مجموعة الحمض النووي، أو مجموعات اخرى من الحمض النووي المستنسخ . التسلسل المهجن النيكليوتايد المهجن بواسطة ( probe ) يتم تحليلها بشكل أكبر، على سبيل المثال، للحصول على الترتيب الكامل للجين المراد . أيضا وصمه ساذرن يمكن ان تستخدم لتحديد مواقع مجموعة الميثل في جين محدد. وعمليا المفيد هو الانزيمات القاطعة ( MspI, HpaII ) كلاهما ينظم ويقسم على نفس تسلسل النيكليوتايد. ولكن ,HpaII يحتاج أن يوجد ميثل على (سايتوسن نيكليوتايد)في ذلك المكان، بينما , MspI يقسمالحمض النووي عند المواقع التي لاتحتوي على مجموعة المثيل لذلك، اي مواقع تحتوي على مجموعة المثيل الموجودة في الترتيب المراد تحليله مع قطعة ( PROBE ) معينة يتم تقطيعها من خلال انزيم المذكور اولا وليس لاخير.[5]

المراجع

  1. "Al-Qamoos القاموس - English Arabic dictionary / قاموس إنجليزي عربي". www.alqamoos.org. مؤرشف من الأصل في 13 يونيو 201813 يونيو 2018.
  2. Southern, Edwin Mellor (5 نوفمبر 1975). "Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis". Journal of Molecular Biology. 98 (3): 503–517. doi:10.1016/S0022-2836(75)80083-0. ISSN 0022-2836. PMID 1195397.
  3. Towbin; Staehelin, T; Gordon, J; et al. (1979). "Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications". PNAS. 76 (9): 4350–4. doi:10.1073/pnas.76.9.4350. PMC . PMID 388439.
  4. Burnette, W. Neal (أبريل 1981). "Western Blotting: Electrophoretic Transfer of Proteins from Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels to Unmodified Nitrocellulose and Radiographic Detection with Antibody and Radioiodinated Protein A". Analytical Biochemistry. 112 (2): 195–203. doi:10.1016/0003-2697(81)90281-5. ISSN 0003-2697. PMID 6266278.
  5. Biochemistry 3rd Edition, Matthews, Van Holde et al, Addison Wesley Publishing, pg 977


موسوعات ذات صلة :