الرئيسيةعريقبحث

عملية التطفير

☰ جدول المحتويات

عملية التطفير في المختبر هي من التقنيات الفعالة في علم الأحياء الجزيئية ذات الأهمية الفائقة للأهداف البحثية،  حيث أنها تقوم على استحداث طفرات في خيط الحامض النووي حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين، وهندسته لمعرفة تأثير ذلك في وظيفته  لإنتاج المطفرات (ذات التغيير الدائم في ترتيب المورثات ) الجينية، البروتينية، سلالات من البكتيريا أو غيرها من الكائنات الحية المعدلة وراثيا. وقد يتم هندسة تلك الطفرات في مكونات الجين المختلفة، مثل عناصر التحكم في إنتاجيته وناتج الجين نفسه،  وكنتيجة يمكن دراسة عمل الجينات أو البروتينات بالتفصيل لتتبع تلك التغييرات،  وتأثيرها في المختبر. بالإضافة لذلك قد تنتج الطفرة أيضا بروتينات متحولة ذات  خصائص مثيرة للاهتمام، أو تعزيز أو استحداث وظائف جديدة لتلك البروتينات،  والتي يمكن الاستفادة منها في الاستخدام التجاري. ويمكن الاستفادة  من إنتاج سلالات الكائنات المعدلة وراثيا  أيضا أن في التطبيق العملي أو تسمح بدراسة  الأساس الجزيئي الخاص بوظيفة خلية معينة.

هناك عدد كبير من الأساليب المطورة لإحداث  الطفرات مخبريا. في البداية، كانت طريقة استحداث  الطفرات تقنيا في المختبر عشوائية تماما، وبعد مراحل من التطور في وقت لاحق أصبحت  الأساليب التقنية الجزيئية  أكثر تحديدا، كالطفرات ذات الموقع المحدد  .أتاحت، منذ عام 2013 ، تقنية كريسبر/البروتين المرتبط بكريسبر 9، والمعتمدة على أساس نظام الدفاع في الفيروسات البدائية، إمكانية تحرير أو احداث طفرات في الجينات في الجسم الحي.[1]

الطفرات العشوائية

اعتمدت الطرق البدائية لتقنية هندسة الطفرات  على الأساليب التي هي تماما عشوائية في الطفرات المنتجة. وقد تتعرض الخلايا أو الكائنات الحية لعوامل مطفرة مثل الأشعة فوق البنفسجية أو عوامل مطفرة من  المواد الكيميائية، بعد ذلك يتم اختيار مطفرات ذات الخصائص المرغوبة . أكتشف العالم هيرمان مولر  أن الأشعة السينية يمكن أن تسبب الطفرات الوراثية في ذباب الفاكهة (نشرت في عام 1927),[2] وذهب إلى استخدام ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا في دراسته في علم الوراثة.[3] ويتم اختيار المطفرات في بكتريا الإشريكية القولونية ،  عن طريق أولا التعرض إلى الأشعة فوق البنفسجية، ثم زراعتها  على أجار (الوسط الغذائي) . وبعد تشكل المستعمرات يتم إعادة زراعتها على وسط غذائي إحداها  الغنية وأخرى الحد الأدنى من المتوسط من الوسط الغذائي، والتي تشتمل على  المتطلبات الغذائية محددة،   ومن ثم يمكن تحديدها بسبب عدم قدرتها على النمو في الحد الأدنى من المتوسط. قد تتكرر إجراءات مماثلة مع أنواع أخرى من الخلايا مع وسائط غذائية مختلفة للاختيار.

وقد تم تطوير عدد من أساليب توليد الطفرات العشوائية في بروتينات معينة  في وقت لاحق والتي تعتمد على مسح أو البحث عن المطفرات محل الاهتمام أو تحسين خصائصها. قد تنطوي هذه الأساليب  على استخدامdoped nucleotides في عملية تكوين النكليوتيدات، أو إجراء تفاعلPCR لعملية تكثير ال DNA في الظروف التي تعزز misincorporation من النيوكليوتيدات (عرضة للخطأ PCR) ، على سبيل المثال عن طريق الحد من الدقة في عملية التكرار أو استخدام نظائر النكليوتيدات .[4] الاختلاف من هذه الطريقة لدمج غير منحازة الطفرات في الجين هو تسلسل تشبع الطفرات.[5] ويتم بعد ذلك اختيار نواتج ال PCR  التي تحتوي على الطفرة/ت ثم استنساخها إلى حوامل أو ناقلات تعبير الشفرة الوراثية، ويتم دراسة خصائص تلك البروتينات المنتجة وتأثير ذلك التغير على وظيفتها.

في الدراسات الحيوانية، يتم استخدام alkylating agents مثلN-ethyl-N-nitrosourea (ENU) لتوليد الفئران الطافرة.[6][7] ويستخدم كثيرا كذلك Ethyl methanesulfonate (EMS)  لتوليد الحيوانات ووالنبات الطافرة.[8][9]

طفرات ذات الموقع المحدد

يسعون العديد من الباحثين إلى إدخال التغييرات المحددة إلى الحمض النووي في الموقع قيد الاهتمام بطريقة محددة. وقد استخدمت في البداية النظير من النيوكليوتيدات وغيرها من المواد الكيميائية لتوليد الطفرة النقطية بموقع محدد.[10] تشمل مثل هذه المواد الكيميائية على مايعرف aminopurine، الذي يشمل تحور القواعد من AT إلى GC [11]، بينما قد تحفز، nitrosoguanidine ،[12] ثاني كبريتيت، [13] و   N4-hydroxycytidine  ، تحور القواعد من GC  إلى AT.[14][15] تسمح هذه التقنيات بهندسة طفرات محددة  في البروتين; ومع ذلك، فهي ليست مرنة فيما يتعلق بالمورثات المتحورة ولا هي محددة كالأنواع المتطورة بعد ذلك، وبالتالي يكون فيها هذه الطريقة قدر من العشوائية.

تعتمد التقنيات الحالية لعملية التطفير ذات الموقع المحدد عادة على استخدام برايمر(بادئات) مطفرة (اليغنوكليوتيد) في عملية امتداد تفاعل أنزيم المبلمر المتسلسل مع الحمض النووي بوليميريز. تسمح هذه الأساليب بحدوث طفرات على مستوى نكليوتيدات، مثل الطفرة النقطية أو حذف أو إدخال أساس أو أكثر إضافي من الحمض النووي في  مواقع محددة. وقد جعلت منهجية التطور لهندسة تلك التقنيات الوراثية من التطفير في المختبر الآن نسبيا عملية بسيطة وفعالة.[16]

ويمكن لعملية طفرات ذات الموقع المحدد أن تنم بشكل منهجي على سبيل المثال أسلوب هندسة طفرات المسح عن الحمض الأميني  alanine scanning في البروتين بحيث يتم استبدال القواعد بشكل منهجي إلى alanine من أجل تحديد المواقع المهمة لبنية أو وظيفة البروتين.

طفرات الاندماج

طفرات الاندماج هي تقنية بموجبها يتم فحص عدد كبير من المطفرات لخاصية معينة. في هذه التقنية، يقام بتغيير في تسلسل أسس بضعة مواقع مختارة أو قصيرة ممتدة على خيط الحامض النووي DNA بطريقة مكثفة،  للحصول على مكتبة شاملة من العديد من البروتينات المعدلة . ومن إحدى خصائص هذه التقنية،  القدرة على القيام بإزالة جزء من الحمض النووي واستبدالها مع مكتبة من تسلسل أسس الحمض النووي المعروفة،  والتي تشتمل على جميع المندمجات الممكنة في موقع الطفرة المطلوبة . وقد يكون هذا الجزء في موقع إنزيم نشط  أو تسلسلات لها أهمية هيكلية أو بنية البروتين المنتج  أو خاصيته المناعية. ومع ذلك أيضا يتم  إدراج ذلك الجزء من تسلسل أسس الحمض النووي بشكل عشوائي في الجين، والذي بدوره يساعد من أجل تقييم تأثير تلك التعديلات بالنسبة لخصائص البروتين الناتج من حيث بنية البروتين أو أهميته الوظيفية،  والتي تعتمد بشكل كبير على حجم هذا التغيير.

طفرات الإدخال

تلعب دورا هاما أبحاث السرطان المهتمة  بهندسة الجينات عن طريق الطفرات المخبرية في تتبع تطور المرض. طفرات الإدخال والتي يتم فيها إدخال أساس أو أكثر إضافي لل DNA باستخدام transposons ، فيروس راجع مثل فايروس mouse mammary tumor    وفايروس murine leukemia virus  لتحديد الجينات المسؤولة عن التسرطن وفهم المسارات البيولوجية لسرطان معين. وقد تستخدم طفرات الإدخال المختلفة لدراسة وظيفة جين معين أيضا.

إعادة التركيب المتماثل (التهجين) 

إعادة التركيب المتماثل،  يمكن استخدامها لإنتاج طفرة محددة في الكائن الحي. يعتمد هذا النوع على ناقلات تحتوي على تسلسل الحمض النووي مشابهة للجينات المراد تعديلها أو تغييرها، ويتم عرضها إلى الخلية،  وتتم هذه العملية بالاستفادة من قدرة ال DNA على التفكك وإعادة البناء، ومن خلالها يتم تكوين هجينا للجين قيد الاهتمام  أو المراد تعديله في الكروموسوم. هذه الطريقة يمكن أن تستخدم لإدخال طفرة أو حذف جين، على سبيل المثال كما تستخدم في إنتاج فئران التجارب knockout mice والتي نزعت منها إحدى المورثات .[17]

تكوين الجينات

ومع انخفاض  تكلفة تكوين تسلسل أسس الحمض النووي (سلسة النكليوتيدات)، أصبحت الآن عملية تكوين جين كامل وسيلة فعالة من أجل استحداث الطفرات في الجينات. ويسمح هذا الأسلوب باستحداث تعديلات وراثية واسعة،  وذات مواقع متعددة على مستوى الصبغيات في الحمص النووي، بما في ذلك إعادة تصميم كاملة من كودون الاستخدام الجيني لتحسين ذلك لكائن معين.[18]

مقالات ذات صلة

المراجع

  1. Hsu PD, Lander ES, Zhang F (June 2014). "Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering". Cell. 157 (6): 1262–78. doi:10.1016/j.cell.2014.05.010. PMC . PMID 24906146.
  2. Muller, H. J. (1927). "Artificial Transmutation of the Gene" ( كتاب إلكتروني PDF ). Science. 66 (1699): 84–87. doi:10.1126/science.66.1699.84. PMID 17802387. مؤرشف من الأصل ( كتاب إلكتروني PDF ) في 10 نوفمبر 2019.
  3. Crow, J. F.; Abrahamson, S. (1997). "Seventy Years Ago: Mutation Becomes Experimental" ( كتاب إلكتروني PDF ). Genetics. 147 (4): 1491–1496. PMID 9409815. مؤرشف من الأصل ( كتاب إلكتروني PDF ) في 9 يناير 2020.
  4. G. Michael Blackburn, المحرر (2006). Nucleic Acids in Chemistry and Biology (الطبعة 3rd). Royal Society of Chemistry. صفحات 191–192.  . مؤرشف من الأصل في 16 فبراير 2020.
  5. Wong, T.S.; Tee, K.L.; Hauer, B.; Schwaneberg, U. (2004). "Sequence Saturation Mutagenesis (SeSaM): a novel method for directed protein evolution". Nucleic Acids Res. 32 (3): e26. مؤرشف من الأصل في 13 مارس 2020.
  6. "Mouse ENU Mutagenesis" ( كتاب إلكتروني PDF ). Human Molecular Genetics. 8 (10): 1955–63. 1999. doi:10.1093/hmg/8.10.1955. PMID 10469849. مؤرشف من الأصل ( كتاب إلكتروني PDF ) في 14 أبريل 2020.
  7. "Large scale ENU screens in the mouse: genetics meets genomics". Mutation Research. 400 (1–2): 25–32. 1998. doi:10.1016/s0027-5107(98)00061-x. PMID 9685575.
  8. "Whole-genome profiling of mutagenesis in Caenorhabditis elegans". Genetics. 185 (2): 431–41. 2010. doi:10.1534/genetics.110.116616. PMID 20439774.
  9. Bökel C (2008). "EMS screens : from mutagenesis to screening and mapping". Methods in Molecular Biology. 420: 119–38. doi:10.1007/978-1-59745-583-1_7. PMID 18641944.
  10. Shortle, D.; Dimaio, D.; Nathans, D. (1981). "Directed Mutagenesis". Annual Review of Genetics. 15: 265–294. doi:10.1146/annurev.ge.15.120181.001405. PMID 6279018.
  11. Caras, I. W.; MacInnes, M. A.; Persing, D. H.; Coffino, P.; Martin Jr, D. W. (1982). "Mechanism of 2-aminopurine mutagenesis in mouse T-lymphosarcoma cells". Molecular and Cellular Biology. 2 (9): 1096–1103. PMID 6983647.
  12. McHugh, G. L.; Miller, C. G. (1974). "Isolation and Characterization of Proline Peptidase Mutants of Salmonella typhimurium". Journal of Bacteriology. 120 (1): 364–371. PMID 4607625.
  13. D Shortle & D Nathans (1978). "Local mutagenesis: a method for generating viral mutants with base substitutions in preselected regions of the viral genome". Proceedings of the National Academy of Sciences. 75 (5): 2170–2174. doi:10.1073/pnas.75.5.2170. PMID 209457.
  14. R A Flavell; D L Sabo; E F Bandle & C Weissmann (1975). "Site-directed mutagenesis: effect of an extracistronic mutation on the in vitro propagation of bacteriophage Qbeta RNA". Proceedings of the National Academy of Sciences. 72 (1): 367–371. doi:10.1073/pnas.72.1.367. PMID 47176.
  15. Willi Müller; Hans Weber; François Meyer; Charles Weissmann (1978). "Site-directed mutagenesis in DNA: Generation of point mutations in cloned β globin complementary DNA at the positions corresponding to amino acids 121 to 123". Journal of Molecular Biology. 124 (2): 343–358. doi:10.1016/0022-2836(78)90303-0. PMID 712841.
  16. Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J. and Wright, D. A. (1996). "Site-directed mutagenesis in one day with >80% efficiency". Strategies. 9 (3): 3–4.
  17. "Homologous Recombination Method (and Knockout Mouse)". Davidson College. مؤرشف من الأصل في 21 أغسطس 2018.
  18. Yury E. Khudyakov, Howard A. Fields, المحرر (25 September 2002). Artificial DNA: Methods and Applications. CRC Press. صفحة 13.  . مؤرشف من الأصل في 25 يناير 2020.

وصلات خارجية

موسوعات ذات صلة :