Phase 1: Guérison de la lésion (5 jours suivant l'amputation)^[3]

Quelques heures suivant l’amputation du membre, la plaie entame dans la phase « wound healing » ou guérison de la plaie. Afin d’initier le cycle de régénération avec cette phase de guérison, les cellules épithéliales vont envahir le site affecté pour former une mince couche transparente d’épithélium^[4]. Ces cellules épithéliales se multiplieront accompagnées des cellules de Leydig qui servent de protection, le tout pour faire une membrane composée de dix couches^[3]. Un autre facteur démontrant ce processus de guérison est la présence d’un léger blanchiment du tissu épithélial dans la région terminale de la plaie^[3]. Ce changement de couleur est associé à une mort graduelle des tissus présents. Il s’ensuit une accumulation de macrophages afin de réduire la distance entre la fine couche d’épithélium aux muscles préexistants^[3]. Cette phagocytose est un élément clé, car elle permet la production de collagène pour faciliter la production de tissu osseux^[5].

Phase 2: Dédifférenciation cellulaire (11 jours depuis l'amputation)^[3]

Une fois que la membrane épithéliale se retrouve à proximité de l’os, les cellules épithéliales ne cesseront de se différencier, jusqu'à la maturation du bourgeon. Cette région centrale se voit de plus en plus vascularisée, stimulée par des signaux nerveux amplifiant la multiplication cellulaire^[3]. Une semaine après l’amputation, cette membrane devient significativement plus épaisse ayant maintenant un capuchon d’épithélium apicale (CEA)^[6]. Aussitôt présent, ce capuchon débutera un recrutement de cellule progénitrice poursuivant cette régénération^[6].

Phase 3: Formation du bourgeon initial (15 jours depuis l'amputation)^[3]

À la suite de l’accumulation des cellules progénitrices, ces dernières participeront à la formation d’un blastème, un groupe de cellules qui assurent la régénération d'un membre. Des cellules sénescentes seront aussi formées^[7]. Retrouvée sous le CEA, l’expansion du blastème implique une meilleure acquisition de capacité embryonnaire et de dédifférenciation des cellules qui le compose afin de débuter la croissance du bourgeon^[6]. Il est important de noter que les échanges entre le CEA et le blastème sont primordiaux pour une régénération optimale d’un membre.

Phase 4: Formation du bourgeon moyen (20 jours suivant l'amputation)^[3]

En raison de l’innervation du blastème par des facteurs de croissance des fibroblastes (FGF) acheminée par des nerfs, la forme blastème est plus prononcée grâce à sa convexité^[3],[6]. Quant au CEA, ce dernier continue de s’épaissir en s’allongeant le long de la couche épithéliale, ressemblant progressivement à un épiderme ^[3]. Du côté basal du blastème, plusieurs masses de cellules à haute densité apparaissent aux alentours de l’os, grâce aux protéines morphogénétiques osseuses (BMP) des vaisseaux sanguins, menant à la création de cartilage^[6].

Phase 5: Formation du bourgeon final (24 jours après l'amputation)^[3]

Puisque la vascularisation se voit riche à ce stade, ceci cause un lobe apical proéminent du blastème marquant la fin du développement du bourgeon^[3]. Cependant, la couche apicale du blastème continue de se différencier en cellules cartilagineuse irriguées par la présence de quelques veines marginales^[3]. Grâce à cette amplification du nombre de cellules cartilagineuse, la formation de cartilage se fait rapidement ^[3]. Pour ce qui est des muscles, leur formation se fait par des cellules musculaires précurseures, mais leur différenciation se fait de façon complexe impliquant plusieurs lignées de cellules dont des cellules mésenchymateuses mononucléaires ainsi qu’une panoplie de gènes tel que Pax7^[8].

Phase 6: Genèse de la palette (30 jours après l'amputation)^[3]

Une fois le cartilage formé, il y a présence du squelette stylopode puis zeugopode ^[9]. Il est important de savoir que toute différenciation se fait dans le blastème, suivi d’un déplacement cellulaire afin d’atteindre une position génétiquement programmée. Le lobe apical proéminent du blastème régresse et s’aplatit formant ainsi une palette ressemblant au début d’un membre^[3]. À mesure que les cellules cartilagineuses se multiplient, la formation de l’autopode débute^[9]. Concernant le CEA, ses cellules se différencieront en kératinocytes afin de former un épiderme^[10].

Phase 7: Croissance des doigts

Durant cette dernière phase du cycle de régénération, les cartilages de l’autopode se prolongent formant ainsi les doigts du membre régénéré de l’Axolotl^[3]. À ce stade, les muscles et vaisseaux sanguins sont présents aux extrémités et contribuent à faciliter la croissance normale du membre. Ce cycle de régénération reprend à chaque fois qu’il y a une nouvelle amputation.

Effets de la température et de la lumière

Plusieurs facteurs peuvent affecter l'efficacité de la régénération des membres. Ces facteurs peuvent être internes, comme la présence d'hormones thyroïdiennes et les taux de glucocorticoïdes^[11]. Cependant, parmi ces facteurs, certains sont intrinsèques comme la température et l'exposition à la lumière. Après avoir observé la régénération à différents moments de l'année, Schaubble, chercheur en médecine pathologique, a constaté une croissance plus rapide des membres pendant les saisons avec des périodes de lumière plus longues, comme la fin du printemps et l'été^[12]. En effet, le taux de croissance était plus lent en hiver avec une extension de 0,35cm en 25 jours, alors que les membres des axolotls dans les environnements plus cléments ont crû de 0,61cm; une augmentation de 57% pour le nouveau membre^[12]. Avec l'augmentation du temps d'exposition à la lumière, la température est également entré en jeu. De cette connaissance, nous pouvons déduire qu'une augmentation de la température entraîne une augmentation du taux de régénération^[13]. Puisque ces différences, au niveau du membre, apparaissaient avec le changement de saisons, Schaubble conclut que la régénération d’un membre est en effet cyclique et non due à l’animal lui-même^[12]. La raison pour laquelle les membres ne poussent pas aussi vite pendant les mois ayant moins d’ensoleillement est due à la libération d’une hormone, la mélatonine, qui se montre plus importante lorsque l’animal est exposé à l’obscurité^[14]. Produite par la glande pinéale, la mélatonine est contrôlée par l’horloge interne de l’axolotl. Cette hormone agit comme un inhibiteur de la mitose^[14]. Ayant une activité diurne accrue, la mitose se déroule lorsque les niveaux de mélatonine chutent. Selon les chercheurs, ce phénomène pourrait être une preuve d’un contrôle rythmique entre la présence de mélatonine et l’activité mitotique dans les cellules du blastème de l’axolotl^[15].

Génétique

Le génome de l’Axolotl est dix fois plus grand que celui de l’humain ce qui cause certaines difficultés pour son étude. Le processus de régénération des membres implique la réactivation du réseau de régulation génique qui permet le développement des membres dans le blastème adulte^[16]. Toutefois, les chercheurs  n’ont pas encore tout à fait trouvé comment la régulation génique s’arrête dans un membre mature adulte et comment celle-ci est réactivée à la suite d'une amputation ^[16].

Une des études qui a été faite pour étudier la génétique de la régénération est celle de Knapp et al. dont le but était d’identifier au moins un gène spécifique relié à l’amputation^[17]. Les Axolotl utilisés dans l'expérience étaient amputés ou blessés et ils étaient placés dans un environnement aquatique propice à leur guérison ou régénération. Les facteurs suivants étaient sous surveillance: la température, le pH et les niveaux d’azote. Les chercheurs ont comparé des échantillons d'un membre amputé et d'un membre simplement blessé^[17]. En comparant l’expression de certains gènes lors de la cicatrisation et de la régénération, seulement 6% de ceux-ci ont montré des modifications d’expression avec une régulation positive plus prononcée lors de la régénération que lors de la cicatrisation des plaies^[17]. Parmi ces gènes se trouvent les gènes reliés au stress-oxydatif. Ils sont généralement plus communs dans la cicatrisation, mais ils ont aussi montré une expression lors de la régénération du membre amputé. En effet, la plupart des gènes importants sont surtout en lien avec les étapes primaires de régénération qui incluent la dédifférenciation et la formation du blastème.

Un aspect important concernant le rythme dans la régénération concerne la mémoire des cellules du blastème. En effet, ces cellules se «souviennent» de leur fonction antérieure avant que le membre ne se fasse amputer. Ces cellules vont se différencier sur une période rythmique d’environ 90 jours pour reformer totalement le membre comme il était au départ ^[18]. Elles vont donc acquérir de nouveau les fonctions de l’os, du muscle, de la peau, du cartilage, etc. Ainsi, avec cette information sur la position, ces cellules du blastème vont interagir et communiquer entre elles en suivant le modèle de coordonnées polaire de régénération ^[18]. Avec ce modèle, les cellules connaissent leur position par rapport aux axes de circonférences du membre amputé et seront guidés encore selon un rythme de division^[18]. Il y a encore peu de recherches qui ont été faites sur l'exactitude des mécanismes chronobiologiques de la régénération chez l’Axolotl.

Toutefois, les chercheurs supposent qu’il y aurait tout de même une horloge qui contrôle le rythme du cycle cellulaire lors de la formation du blastème. Ainsi, la division cellulaire (mitose) serait contrôlée par un rythme où les phases G1, S, G2 et M ont des régulations différentes^[17].Ainsi, on voit une rythmicité dans l’expression de chaque phase lors de la régénération. Les chercheurs déduisent donc l'importance de cette horloge interne puisque la régénération du membre ne pourrait pas avoir lieu sans la mitose qui est contrôlée de façon rythmique^[18]. Ainsi, les phases G1 et S ont montré une expression prononcée à partir de 24h après l’amputation avec un pic à 72 heures. Pour les phases G2 et M, leur pic d’expression était autour de 120h après l’amputation. On peut donc conclure que cette apparition précoce de la prolifération cellulaire est associée à une lésion tissulaire^[17]. On observe également une expression plus tardive du régulateur du cycle cellulaire. Ceci correspond à l’accumulation des cellules qui forment le blastème. Il y a donc un rythme relié à la régénération qui fait en sorte de modifier les patrons de divisions cellulaires^[17].

Des micro-ARN jouent aussi un rôle essentiel dans le rythme et le contrôle de l'expression des gènes reliés à la régénération^[19]. Un des gènes importants parmi ceux-ci fait partie de la famille Wnt (Wnt/b-catenin) dont la rythmicité est présente durant les 3 à 24 premières heures après l’amputation^[17]. Une autre famille de gènes a aussi montré une expression importante lors de la régénération: les facteurs de croissance des fibroblastes (FGF)^[17]. Par exemple, les gènes Fgf8 et Fgf10 sont essentiels pour la croissance et la structure du bourgeon du membre amputé. Ils jouent un rôle crucial dans la formation de l’ectoderme et des composants du mésenchyme^[17]. Plus précisément, en comparant l'expression du gène Fgfs10 dans l'échantillon amputé et dans l'échantillon blessé, ce gène a montré une forte régulation 24 heures après l'événement spécifique (l'amputation ou la simple blessure). Cette hausse de régulation était plus prononcée dans l'échantillon amputé que dans celui avec une simple blessure^[17].

Une panoplie d'autres gènes ont été identifiés comme étant spécifiques à la régénération d'un membre chez l'Axolotl^[17]. Ces gènes montrent généralement tous une prédominance à un moment précis pour ensuite ne plus être exprimé après la régénération complète du membre amputé. Plusieurs méthodes génétiques, moléculaires et mathématiques sont ainsi utilisées dans le but de comprendre la génétique derrière ce cycle de régénération^[17]. En passant par l'hybridation in situ, la méthode de CRISPR/Cas9 et la méthode d'analyse ANOVA, le mécanisme de régénération chez l'Axolotl reste d'une grande utilité non seulement pour les espèces semblables, mais également pour l'Humain dans des cas d'études sur le cancer, par exemple^[1],[17].